Koimobilizacija alkohol dehidrogenaze in nikotinamid adenin dinukleotida na magnetne nanodelceOprešnik, Tina (Avtor) Leitgeb, Maja (Mentor) Vasić, Katja (Komentor) alkohol dehidrogenazaNAD+koimobilizacijamagnetni nanodelciCM-dekstranNamen magistrske naloge je bil sintetizirati magnetne nanodelce s koprecipitacijo železovih oksidov, jih prevleči z CM-dekstranom ter na njih preučiti koimobilizacijo encima ADH ter kofaktorja NAD+. Po aktivaciji nanonosilcev z mrežnim povezovalcem EClH smo na njih koimobilizirali ADH in NAD+. Prostemu in imobiliziranemu encimu smo določali aktivnost z encimskim aktivnostnim testom ter izračunali preostalo aktivnost encima. Bradfordova metoda nam je služila za določanje koncentracije proteinov, s pomočjo katere smo imobilizirani ADH izračunali učinkovitost imobilizacije. Postopek koimobilizacije smo optimizirali s spreminjanjem imobilizacijskih pogojev, in sicer mase magnetnih nanodelcev, izbire mrežnega povezovalca (EClH ali GA), časa aktivacije magnetnih nanodelcev, zaporedja, časa in temperature koimobilizacije, koncentracije kofaktorja in koncentracije encima. Po določitvi optimalnih pogojev smo raziskali termično stabilnost prostega in imobiliziranega encima ter možnost skladiščenja imobiliziranega encima. Eksperimentalno smo Michaelisovi konstanti določili (KM) prosti in imobilizirani ADH. Pri optimalnih imobilizacijskih pogojih (50 mg magnetnih nanodelcev, 2 h aktivacije nanonosilcev z EClH, 2 h imobilizacije NAD+ s koncentracijo 20 mM, 4 h imobilizacije ADH s koncentracijo 0,01 mg/mL, sobna temperatura, hitrost stresanja 350 obr/min) smo dosegli najvišjo 73 % preostalo aktivnost ADH in 94 % učinkovitost imobilizacije. Imobiliziran encim je bil v primerjavi s prostim encimom termično stabilnejši, prav tako ga je bilo mogoče skladiščiti pri 4 °C. Eksperimentalno določena KM je bila pri imobilizirani ADH višja.[T. Oprešnik]20192019-06-19 21:43:02Magistrsko delo/naloga73836sl