Subcelična frakcionacija humanih mononuklearnih celic periferne krvi in izolacija proteinov iz različnih celičnih kompartmentovSimonič, Dea (Avtor) Potočnik, Uroš (Mentor) Goričan, Larisa (Komentor) MCPKsubcelična frakcionacijaizolacija proteinov iz različnih celičnih kompartmentovlizni pufriwestern prenosMononuklearne celice periferne krvi (MCPK) so ključna komponenta imunskega sistema za boj proti infekcijam in prilagajanje patogenom. MCPK se nahajajo v periferni venski krvi in predstavljajo lahko dostopen vir imunskih celic za nadaljnje imunske in toksikološke raziskave, pomembne so pri analizi genske in proteinske ekspresije v krvi, proteini MCPK pa predstavljajo pomembne biomarkerje imunskih in možganskožilnih bolezni. V večini standardnih postopkov lize celice se za tvorbo celičnega lizata uporablja en sam lizni pufer, kar lahko vodi do nespecifičnih interakcij proteinov, raztapljanja proteinov v pufru, ki jih ne želimo analizirati, prav tako so možne težave s topnostjo proteina v pufru. Analiza proteinov s subceličnim frakcioniranjem (s sekvenčno uporabo več liznih pufrov) pa med drugim poveča možnosti, da je željeni protein izoliran in bistveno zmanjša možnost kontaminacije z drugimi proteini. Subcelično frakcioniranje prav tako omogoča pridobitev informacije o tem kako se porazdelitev posameznih proteinov razlikuje med različnimi subceličnimi kompartmenti, celicami in tkivi, ter daje informacijo o stanju celic in o aktivaciji signalnih poti. V diplomski nalogi smo optimizirali protokol za izolacijo proteinov s subcelično frakcionacijo iz svežih MCPK, povzet iz članka Holden P., Horton W. A.: Crude subcellular fractions of cultured mammalian cell lines, ki opisuje optimizacijo protokola za gojene celične linije sesalcev. V sklopu naloge smo optimizirali koncentracijo digitonina v digitonin pufru in volumne ostalih pufrov za subcelično frakcionacijo. Optimiziran protokol za izolacijo proteinov s subcelično frakcionacijo svežih MCPK smo primerjali z izolacijo proteinov z dodatkom enega samega liznega pufra ter izbrane optimizirane pogoje preverili tudi na zamrznjenih MCPK. Vse izolirani proteine smo analizirali z metodo western prenosa (WB) in rezultate kvantificirali s programom ImageLab. S testiranjem različnih koncentracij digitonina v digitonin pufru in na podlagi WB analize za proteinske markerje α-tubulin, citratna sintaza (CS) in histonska deacetilaza 6 (HDA-C6) smo ugotovili, da je optimalna koncentracija digitonina v digitonin pufru, za izolacijo le citosolnih proteinov svežih vzorcev MCPK, 50 μg/mL. Z optimizacijo koncentracije digitonina in volumnov dodanih liznih pufrov smo ločeno izolirali citosolne proteine, proteine membranskih organelov, jedra in netopnih proteinov. Ugotovili smo, da je izplen izoliranih proteinov pri izolaciji s subcelično frakcionacijo večji kot pri direktni izolaciji proteinov z dodatkom enega samega liznega pufra.[D. Simonič]20212021-08-25 19:59:45Diplomsko delo/naloga80004sl