Optimizacija transfekcije ekspresijskih plazmidov v celično linijo HMEC-1Tevž, Nina (Avtor) Potočnik, Uroš (Mentor) Gole, Boris (Komentor) HMEC-1lipofekcijaoptimizacija transfekcijeGFP-plazmidViaFectFuGENELipofectamine LTX&PLUScelična viabilnostStalna celična linija HMEC-1 (Human Microvascular Endothelial Cells-1) predstavlja pomemben in vitro celični model za proučevanje delovanja človeškega mikrovaskularnega endotelija. V primerjavi s primarnimi celicami ponuja daljšo življenjsko dobo, manjšo biološko variabilnost ter boljšo ponovljivost poskusov, pri čemer ohranja ključne endotelijske fenotipske značilnosti. Za funkcionalne raziskave in genske manipulacije celične linije HMEC-1 je ključnega pomena doseganje učinkovite transfekcije. Ker HMEC-1 spada med celične sisteme, ki jih je težje transfecirati, in ker univerzalen protokol za vse celične linije ne obstaja, smo v okviru tega dela izvedli natančno optimizacijo pogojev transfekcije. V diplomskem delu smo za optimizacijo transfekcije uporabili plazmid pCMV6-AC-GFP ter tri kationske transfekcijske reagente: FuGENE 4K, ViaFect ter Lipofectamine LTX & PLUS. Optimizacijski protokol na 96-jamičnih mikrotitrskih ploščah je potekal v štirih zaporednih korakih, ki so zajemali določitev optimalne gostote nacepljanja celic, optimizacijo razmerja med reagentom in plazmidno DNA, določitev optimalne količine DNA ter optimizacijo časa inkubacije transfekcijske mešanice. Uspešnost transfekcije in število celic smo ocenjevali z avtomatizirano imunofluorescenčno mikroskopijo na sistemu Cytation 5 po barvanju z barviloma Kalcein AM in Hoechst 33342. Z merjenjem fluorescenčnega signala smo ugotovili, da je bila optimalna gostota nacepljanja 25.000 celic na jamico, saj pri višjih gostotah konfluenca ni več naraščala. Pri optimizaciji parametrov se je reagent FuGENE 4K izkazal za najboljšega pri razmerju 4:1, količini 100 ng DNA in času inkubacije 15 minut. Lipofectamine LTX & PLUS je dosegel največjo učinkovitost pri razmerju 0,4:1, 100 ng DNA in 5 minutah inkubacije. Reagent ViaFect pa je izkazal najvišjo skupno učinkovitost transfekcije pri razmerju 6:1, količini 100 ng DNA ter 10 minutah inkubacije. Spremljanje v časovnih intervalih ter uporaba negativnih kontrol sta potrdili stabilnost izražanja signala. Z merjenjem metabolne aktivnosti z Alamar modrim smo ugotovili, da je reagent FuGENE izkazal precejšnjo citotoksičnost, medtem ko sta ViaFect in Lipofectamine ohranila visoko viabilnost celic. Naš zaključek je, da reagent ViaFect ob uporabi optimiziranih pogojev predstavlja najučinkovitejši sistem za transfekcijo linije HMEC-1.20262026-09-08 10:52:11Diplomsko delo/naloga100202sl