FIZIOLOŠKO PRILAGAJANJE OBČUTLJIVOSTI APARATA ZA ZLIVANJE SEKRETORNIH MEŠIČKOV NA KALCIJEVE IONE CELIC BETA TREBUŠNE SLINAVKESkelin, Maša (Avtor) Rupnik, Marjan (Mentor) beta celiceeksocitozaproteinske kinazeobčutljivost na kalcijizločanje inzulinaRaziskovali smo vlogo proteinskih kinaz v procesu uravnavane eksocitoze v celicah beta trebušne slinavke. Za stimulacijo od Ca2+ odvisne sekrecije smo uporabili vlak depolarizacijskih pulzov ali počasno fotolizo, s katerima smo kontrolirali znotrajcelično aktivnost Ca2+ ionov. S pomočjo meritev kapacitivnosti celične membrane smo zasledovali eksocitozo, to je zlivanje sekretornih mešičkov s plazemsko membrano. Pri kontroli je zadostna sprememba Ca2+ sprožila vsaj dve fazi eksocitoze. Hitrost spremembe kapacitivnosti je v odvisnosti od [Ca2+]i razkrila saturacijsko kinetiko z visoko kooperativnostjo, pri čemer je bila polovica maksimalne hitrosti dosežena pri 2,9 ± 0,2 µM kalcija. Nato smo z dodajanjem cAMP ugotavljali vlogo PKA v procesu eksocitoze. Naši rezultati kažejo, da cAMP stimulira eksocitozo pri značilno nižji [Ca2+]i v primerjavi s kontrolo. Enake rezultate smo dobili, ko smo s 6-Phe-cAMP direktno stimulirali PKA, medtem ko aktivacija Epac2, ki je prav tako ena izmed poti delovanja cAMP, ni imela posebnega vpliva na spremembo občutljivosti sekretornega aparata. V nadaljevanju smo preučili še vlogo PKC in Cdk5 v procesu izločanja inzulina. Aktivacija PKC je znižala občutljivost prve faze eksocitoze v primerjavi z inhibicijo PKC, medtem ko je inhibicija Cdk5 zmanjšala hitrost zlivanja sekretornih mešičkov s plazemsko membrano, pri čemer je ostala občutljivost na [Ca2+]i nespremenjena. Ker literatura navaja, da PKC in Cdk5 fosforilirata vrsto proteinov, vključenih v mehanizem sekrecije, smo testirali vlogo Munc18-1, ki je po našem mnenju ena najbolj verjetnih fosforilacijskih tarč PKC in Cdk5. Povišana ekspresija PKC fosforilacijske mutante Munc18-1 je značilno znižala amplitudo prve faze eksocitoze in zvišala njeno občutljivost na [Ca2+]i. Amp1 je bila značilno nižja tudi pri povišani ekspresiji Cdk5 fosforilacijske mutante Munc18-1, vendar je bila njena občutljivost na [Ca2+]i tokrat značilno nižja. Prav tako je bila značilno nižja tudi hitrost zlivanja mešičkov s plazemsko membrano. Naši rezultati tako potrjujejo hipotezo, da cAMP v celicah beta spremeni občutljivost sekretornega aparata na Ca2+ ione z aktivacijo PKA. Tudi PKC in Cdk5 sta z delovanjem preko proteina Munc18-1 pomembna regulatorja eksocitoze, pri čemer je PKC pomembna za preprečevanje zlivanja mešičkov s plazemsko membrano pri nezadostni [Ca2+]i, Cdk5 pa sodeluje v pripravi mešičkov na zlitje. 20112013-03-11 13:21:11Doktorska disertacija39863COBISS_ID: 255650048NUK URN: URN:SI:UM:DK:F28E1M60sl