Uporaba selektivnih membran za pripravo proteinskih vzorcev krvne plazme za določanje citokinov z masno spektrometrijoZorko, Katja (Avtor) Potočnik, Uroš (Mentor) Petek, Maya (Komentor) citokiniimunski odzivnHPLC-HRMSultrafiltracijski filtri AmiconSDS-PAGEmasna spektrometrijaImunski sistem je sistem celic, kemičnih signalov in bioloških procesov, ki ščitijo organizem pred tujimi antigeni, kot so mikrobi, virusi, rakave celice in toksini. Prirojena imunost je obrambni mehanizem, ki se sproži takoj ali v nekaj urah po srečanju z antigenom in nima imunskega spomina. Glavna naloga prirojene imunosti je hitro pridobivanje citokinov, majhnih signalnih proteinov, ki sodelujejo pri celični komunikaciji in imunskih odzivih na mestih okužbe in vnetja. Glede na izjemno nizko koncentracijo citokinov v krvni plazmi le-te z masno spektrometrijo težko določimo. Signali citokinov se namreč izgubijo med močnejšimi signali visoko koncentriranih proteinov kot so albumin in imunoglobulini. Ker pa so ti proteini bistveno večji smo jih iz vzorcev odstranili z uporabo selektivnih membranskih filtrov, ki so prehodni samo za proteine do določene velikosti. Namen diplomske naloge je bila optimizacija postopka za pripravo proteinskih vzorcev krvne plazme za določanje citokinov z masno spektrometrijo. Uporabili smo dva postopka za izolacijo proteinov: uporaba selektivnih membranskih filtrov Amicon in gelska elektroforeza (SDS-PAGE). Sledili sta identifikacija in relativna kvantifikacija citokinov v krvni plazmi z metodo nHPLC-HRMS. Uporaba ultrafiltracijskih filtrov Amicon velja za enostavno in zanesljivo metodo koncentracije beljakovin. Med seboj smo primerjali delovanje filtrov z različnimi velikostmi por, ki prepuščajo proteine do velikosti 30 kDa, 10 kDa in 3 kDa. Filtri so pokazali primerljive rezultate med eksperimenti, vendar pa med njihovo uporabo ni bilo opaznih bistvenih razlik. SDS-PAGE je tehnika za ločevanje beljakovin glede na njihovo velikost s pomočjo ustvarjenega električnega polja. Velja za zahtevnejšo in zamudnejšo metodo izolacije proteinov. Pri določanju citokinov se je gelska elektroforeza izkazala za neuspešno, saj je bila koncentracija proteinov po filtraciji premajhna za uspešno vizualizacijo na gelu.[K. Zorko]20232023-03-09 12:34:50Diplomsko delo/naloga83909UDK: 543.51:615.382(043.2)COBISS_ID: 147501315sl