| Opis: | Kljub veliki razpoložljivosti različnih zdravilnih učinkovin, veliko bolnikom še vedno primanjkuje učinkovitih in varnih rešitev za zdravljenje njihovih specifičnih bolezni. Slednje kaže na kontinuirano potrebno po razvoju novih zdravil.Kljub relativno velikemu številu razpoložljivih modelov, se njihova uporabna vrednost razlikuje od primera do primera, pri čemer noben ni idealen za vse. V doktorski disertaciji smo se osredotočili na razvoj nove metodo za določanje viabilnosti (imenovane »Test viabilnosti celičnega membranskega potenciala«, angl. Membrane potential cell viability assay«, MPCVA) in novega in vitro modela jeter, s katerimi smo želeli nasloviti nekatere ključne pomanjkljivosti razpoložljivih toksikoloških modelov.
Ker se večina obstoječih metod opira na posredno določanje celične smrti (metabolizem, molekularni transport in uhajanje, če jih naštejemo le nekaj), smo razvili novo metodo za neposredno merjenje celične smrti preko merjenja spremembe v membranskem potencialu. Metodo smo testirali na dveh vrstah celic: krvni makrofagi (TLT-celice) in epitelijske rakaste celice dojke (MCF7).
Jetrni model in vitro smo pripravili s kombinacijo štirih glavnih vrst jetrnih celic: hepatociti, jetrnimi stelatnimi celicami (HSC), Kupfferjevimi celicami in jetrnimi sinusoidnimi endotelijskimi celicami (LSEC). Uporabljali smo različne kombinacije osnovnih značilnosti modela (sestava in prostornina celičnega gojišča, delež celic in dodajanje zunajceličnega matriksa), da smo določili najprimernejšo kombinacijo lastnosti za posnemanje reprezentativnega in vivo okolja za delovanje jetrnega modela in vitro. Med vsemi kombinacijami smo izbrali konfiguracijo, ki je najbolj natančno posnemala anatomske in fiziološke razmere in vivo.
Za validacijo metode MPCVA smo določali korelacijo med membranskim potencialom in viabilnostjo celic v posameznih celicah. V nadzorovanih preskusnih pogojih je metoda MPCVA pokazala dobro natančnost ocene toksičnosti pri primerjavi z uveljavljenimi metodami. Opazili smo tudi različne trende pri merjenju rezultatov, odvisno od celične smrti, kar je dober pokazatelj uporabnost metode v različnih eksperimentalnih scenarijih.
Sestava in prostornina celičnega gojišča sta imeli signifikanten vpliv na morfologijo in fiziologijo novega modela jeter in vitro. Izbrana konfiguracija modela je imela primerljive morfološke in fiziološke parametre z razpoložljivimi kliničnimi podatki, ko smo dodali hepatotoksične zdravilne učinkovine. Ob dodatku zdravilnih učinkovin nismo opazili bistvenega toksičnega odgovora pri hepatocitih, medtem ko so bile Kupferjeve in jetrne sinusoidne endotelijske celice (angl. liver sinusoidal endothelial cells, LSEC) najobčutljivejše.
Preko uporabljenih analiznih metod se je metoda MPCVA pokazala kot primerljiva z obstoječimi metodami za merjenje celične smrti in ima posledično velik potencial za nadaljnjo uporabo in to tudi v okoliščinah, ko druge metode odpovejo. Slednje še posebej velja, saj ima zaradi neposrednega merjenja metoda MPCVA manjšo verjetnost, da bo prišlo do neustreznega odziva. S tem se zmanjšuje možnost zajema lažnih pozitivnih odzivov, saj metoda ni odvisna od drugih posrednih mehanizmov, ki potekajo v celicah (npr. spremembe v metabolizmu, spremembe v sintezi encimov, spremembe v prehodnosti membrane, itd.).
Nov model in vitro je imel primerljive fiziološke odzive in morfološke lastnosti kot klinične podatke. To je pokazatelj, da nov model lahko primerno simulira ključne lastnosti in vivo okolja, s čemer je primeren za določanje toksičnosti zdravil v podobnih okoliščinah kot smo jih uporabili v nalogi.
Kljub širokemu naboru uporabljenih metod in poskusov v nalogi, se zavedamo, da bo potrebno izvesti nadaljnje študije z dodatnimi zdravilni učinkovinami, da bi ugotovili splošni potencial razvitega modela jeter in vitro kot integriranega pristopa za testiranje in ocenjevanje (angl. integrated assessment and testing aproach, IATA). |
|---|
